食物中泛酸的測定方法
微生物測定法

1.原理
泛酸對于Lactobacillusplantarum（ATCC8014）的正常生長是一種必需的營養素，在一定生長條件下，Lactobacillusplantarum的生長與繁殖速度同樣品中泛酸的含量成一定的線性關系，通過利用濁度法或光密度法測定細菌增殖的強度即可間接地檢測出食物樣品中泛酸的含量。本方法最低檢出限為5ng。

2.適用范圍
本方法參考"Official Methods of Analysis of the Association ofofficialAnalytical Chemists"、"Methods of VitaminAnalysis"以及"Methods of theMicrobiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法適用于測定各類食物（包括天然食物及加工食物）及飼料中的泛酸含量。
3.試劑
本試驗用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純試劑。
3.1甲苯
3.2 1mol/L鹽酸溶液
3.3 Tris緩沖溶液：將24.2三羥基氨基甲烷溶于150ml水中，用7.5mol/LNaOH調pH至8.0~8.3，然后定容至200ml，貯存于4℃冰箱中，可保存2周。
3.4 7.5mol/L氫氧化鈉溶液：溶150g氫氧化鈉于水中，定容至500ml。
3.5 2mol/L醋酸：12ml冰醋酸用水定容至1000ml。
3.6 2mol/L醋酸鈉溶液：將16.4g醋酸鈉用水定容至1000ml。
3.7 2mol/L碳酸氫鉀溶液：稱取10.012g碳酸氫鉀溶于水中，然后定容至500ml。
3.82%堿性磷酸酶溶液：稱取2g堿性磷酸酶（Sigma公司No.P-3877）溶于水中，然后定容至100ml。貯存于4℃冰箱中保存。
3.910%鴿子肝臟提取物溶液：將所用容器在配制此試劑前一天放入4℃冰箱中過夜。(1)稱取30g鴿子肝臟丙酮提取物粉末（Sigma公司,No.L-8376）放入冷的研缽中，分兩次加入300 ml 0.2NKHCO3,至0℃的冰浴中研磨均勻直至呈懸濁液；(2)將此懸濁液分別放入8支離心管中，塞緊后充分振搖，冷凍10分鐘，然后3000轉離心5分鐘；(3)將上清夜放入500ml預冷的廣口燒瓶中，加150g活性Dowex1-X8（Bio-RadLaboratories, Inc.,Brussels, Belgium）,放在冰浴中震搖5分鐘；將混合液倒入離心管中，3000轉離心5分鐘；(4)再將上清液移入另一個冷的500ml廣口燒瓶中，冷凍10分鐘；(5)重復上述(3)、(4)步驟一次；(6)然后分裝于試管中，冷凍條件下保存，用前化凍。
3.10 酸解酪蛋白液：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200ml3mol/L鹽酸，于壓力蒸汽消毒器內10.3×104Pa（15lb/in2）壓力下水解6小時。將水解物轉移至蒸發皿內，在沸水浴上蒸發至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發至膏狀，如此反復3次，以去除鹽酸。以溴酚藍作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調節pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復處理。濾液加水稀釋至500ml，貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
?酸解的目的是為了去除酪蛋白中的維生素，使基本培養基中不含待測定的維生素，但有時酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉，這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含生物素。
3.11 胱氨酸-色氨酸溶液：稱取4g L-胱氨酸和1gL-色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800ml水中，加熱至70-80℃，逐滴加入（1+5）的鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
3.12腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產生，加鹽酸數滴，再加熱，如此反復，直至冷卻后無沉淀產生為止，以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
3.13 吐溫80溶液：將25g吐溫溶于乙醇中并定容至250ml。
3.14維生素溶液Ⅰ：稱取20mg核黃素，10mg鹽酸硫胺素，0.04mg生物素，用0.02mol/L醋酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15維生素溶液Ⅱ：10mg對氨基苯甲酸，50mg尼克酸，40mg鹽酸吡哆醇，溶于（1+3）的乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 鹽溶液A：稱取25g磷酸二氫鉀和25g磷酸氫二鉀溶于500ml水中，加5滴濃鹽酸。
3.17 鹽溶液B：稱取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO47H2O、23ml 85% H3PO4，溶于水中并定容至500ml。
3.18 泛酸標準溶液溶液

名稱
 濃度
 配置方法
 
標準

儲備液
 40μg / ml
 稱取43.47mgD-泛酸鈣（Sigma公司，No. P-2250）標準物，溶解于500ml 水中，加入10ml 0.2mol/L的醋酸，100ml 0.2mol/L醋酸鈉，然后用水定容至1000ml，此時溶液的泛酸鈣濃度為43.47μg / ml，相當于泛酸濃度為40μg / ml，貯存于2-4℃冰箱中。
 
標準

中間液
 1.0μg / ml
 取25ml儲備液放入500ml水中，再加入10mlmol/L的醋酸，100ml 0.2mol/L醋酸鈉，然后用水定容至1000ml，在2-4℃冰箱中貯存。
 
標準

工作液
 10 ng / ml
 取1ml中間液用水定容至100ml，在2-4℃冰箱中貯存。
 

3.19基本培養基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚藍作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調節pH至6.8，用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
胱氨酸、色氨酸溶液 25ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml
維生素溶液Ⅰ 5ml
維生素溶液Ⅱ 5ml
鹽溶液A 5ml
鹽溶液B 5ml
無水葡萄糖 10g
三水醋酸鈉 8.3g
吐溫80溶液 0.25ml
此培養基也可從Difco公司購得，產品號為0816-15-7。
? 由于國內的某些試劑純度不夠，所以自行配制的培養基較渾濁，嚴重影響到最后的濁度測定結果，因此建議使用進口培養基。
3.20瓊脂培養基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫80，加熱溶解，用40%氫氧化鈉調節pH為6.5~6.8，然后定容至1000ml，每500ml液體培養基加5.0~7.5g瓊脂，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱2-4℃條件下保存。
3.21生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時分別到入2~4支10ml試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，備用。
3.22 0.04%溴麝香草酚藍溶液：稱取0.1g溴麝香草酚藍于小研缽內，加1.6ml0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.23 0.04%溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠于小研缽中，加1.4ml0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.24 0.1%溴酚藍乙醇溶液：稱取0.1g溴酚藍，用乙醇溶解后，加乙醇稀釋至100ml。
3.25 番茄汁：將新鮮番茄去皮、去籽，制成勻漿后，用紗布過濾數次，直至呈淡黃色透明液體，在液面上加幾滴甲苯，冷凍保存。
4.儀器與設備
4.1 實驗室常用設備
4.2 電熱恒溫培養箱
4.3 壓力蒸汽消毒器
4.4 液體快速混合器
4.5 離心機
4.6 722分光光度計
4.7 硬質玻璃試管：20mm×150mm
5.菌種與培養液的制備與保存
5.1 儲備菌種的制備：Lactobacillusplantarum（ATCC8014）接種于直面瓊脂培養管中，在37±0.5℃恒溫箱中培養16~24小時，取出后放入冰箱中保存，每隔兩周至少傳種一次。在實驗前一天必須傳種一次。
5.2種子培養液的制備：加2ml泛酸標準工作液和3ml基本培養基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出，冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。
?加入離心管中的泛酸標準液要適量，過少會影響Lactobacillusplantarum的生長，過多則不宜于洗凈殘余泛酸，因此會使零管中的光密度值增大，影響測定結果的準確性。一般2-3ml標準工作液即可。
6.操作步驟
6.1接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長16-24小時的L.plantarum接種于種子培養液中，在37±0.5℃培養16-24小時，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄取上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。
6.2 樣品制備：
稱取適量樣品，放入100ml三角瓶中，加10mlTris緩沖液，加蒸餾水30ml，混勻于121℃高壓條件下水解15分鐘，取出冷卻至室溫，定容至50ml，過濾。
? 泛酸在空氣中穩定，但對于熱不穩定，因此水解時間切勿過長。
取1ml樣品液（5.2.1.），加入0.4ml堿性磷酸酶溶液，0.2ml肝臟提取物溶液，0.1ml碳酸氫鈉溶液，0.4ml蒸餾水，混勻后，37℃溫箱中培養過夜。
加水至20ml，以溴甲酚綠為外指示劑，用冰醋酸調節pH=4.5，定容至25ml，過濾。
取適量水解液（5.2.3）于25ml具塞刻度試管中，以溴麝香草酚藍為外指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉調節至pH=6.8，用水定容至某刻度。
樣品試管的制備：于平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液（5.2.4），加水至5ml，然后再加入5ml基本液體培養基。
6.3標準管的制備
每組試管中分別加入泛酸標準工作液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml（相當0.0、10.0、20.0、 30.0、40.0、50.0ng泛酸），加水至5ml，再加入5 ml基本液體培養基， 需做三組標準曲線。。
6.4滅菌：樣品管與標準管均用棉塞塞好，于121℃高壓滅菌10分鐘。
?滅菌時間不宜過長，否則會破壞基本培養基中的營養成分，影響Lactobacillusplantarum的生長，最好在5-10分鐘內。
6.5 接種與培養：待試管冷至室溫后，每管接種一滴種子液，于37±0.5℃恒溫箱中培養16~20小時。
?（1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。（2）在接種時，其中一支標準系列0管可不接種，這樣可觀察此次實驗是否存在污染，并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.6 測定：722分光光度計，波長640nm條件下，以標準系列0管儀器調零，測定樣品管及標準管的吸光度值。
? 首先以未接種的標準系列0管進行儀器調零，然后再用接種后的標準系列0管進行二次調零，之后再測定其他管中液體的光密度值。
7.計算
以泛酸標準系列的不同納克數為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制做標準曲線。在曲線上查出相對應的樣品測定管中的泛酸含量，然后再按以下公式計算樣品中泛酸含量：
    C·V·F
X=-------------- ×100
     m×1000
式中
X ── 樣品中泛酸含量，μg/100g：
C ── 測定管中的泛酸含量，ng：
V ── 樣品水解液的定容體積，ml：
F ── 樣品液的稀釋倍數
m ── 樣品質量，g。
100/1000 ── 單位換算系數