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  • 食物中維生素B2(核黃素)的測定方法

    發布于 2011/12/05閱讀(1781)來源 zxj標簽 熒光光度計

    摘要

    食物中維生素B2(核黃素)的測定方法

    內容

    硅鎂吸附劑凈化熒光法
    1. 原理
    核黃素在440~500nm波長光照射下發生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強度與核黃素的濃度成正比。利用硅鎂吸附劑對核黃素的吸附作用去除樣品中的干擾熒光測定的雜質,然后洗脫核黃素,測定其熒光強度。試液再加入低亞硫酸鈉(Na2S2O4),將核黃素還原為無熒光的物質,再測定試液中殘余熒光雜質的熒光強度,兩者之差即為食品中核黃素所產生的熒光強度。
    2.方法來源
    參照GB12391-1990 本方法適用于食物及飼料中核黃素的測定。
    3. 儀器
    1) 高壓消毒鍋
    2) 電熱恒溫培養箱
    3) 核黃素吸附柱
    4) 熒光分光光度計。
    4. 試劑
    試驗用水為蒸餾水。試劑不加說明者為分析純。
    4.1 硅鎂吸附劑:60~100目,sigma 公司產品。
    4.2 2.5mol/L無水乙酸鈉溶液。
    4.3 10%木瓜蛋白酶:用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時現配制。
    4.4 10%淀粉酶:用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時現配制。
    4.5 0.1 mol/L鹽酸
    4.6 1 mol/L氫氧化鈉
    4.7 0.1 mol/L氫氧化鈉
    4.8 20%(w/v)低亞硫酸鈉溶液:此液用時現配。
    4.9 洗脫液:丙酮+冰醋酸+水(5+2+9)
    4.10 0.04%溴甲酚綠指示劑
    4.11 3%(v/v)高錳酸鉀溶液:
    4.12 3%(v/v)過氧化氫溶液:
    4.13 核黃素標準液的配制:(純度>98%sigma公司)。
    A) 核黃素標準儲備液:(25μg/mL)將標準品核黃素粉狀結晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。經過24小時后,準確稱取50mg,置于2L容量瓶中,加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。將容量瓶置于溫水中搖動,待其溶解,冷卻至室溫,稀釋至2L,移至棕色瓶中,加少許甲苯復蓋于溶液表面,于冰箱中保存。
    B) 核黃素標準使用液:吸取2.00mL核黃素標準儲備液,置于50ml棕色容量瓶中,用水稀釋至刻度。避光,貯于4℃冰箱,可保存一周。此溶液每毫升相當于1.00μg核黃素。
    5.操作步驟
    整個操作過程需避光進行。
    5.1 樣品提取
    1) 水解:稱取2~10g樣品(約含10~200μg 核黃素)于100ml三角瓶中,50mL0.1mol/L鹽酸,攪拌直到顆粒物分散均勻。用40ml瓷坩堝為蓋扣住瓶口,于121℃高壓水解樣品30min。水解液冷卻后,滴加1mol/L氫氧化鈉,用0.04%溴甲酚綠作外指示劑調至pH為4.5。
    2) 酶解
    A) 含有淀粉的水解液:加入3ml10%淀粉酶溶液,于37~40℃保溫約16h。
    B) 含高蛋白的水解液:加3ml10%木瓜蛋白酶溶液,于37~40℃約16h。
    5.2 過濾:上述酶解液定容至100.0ml,用干濾紙過濾。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
    5.3 氧化去雜質:視樣品中核黃素的含量取一定體積的樣品提取液及核黃素標準使用液(約含1~10μg核黃素)分別于20ml的帶蓋刻度試管中,加水至15ml。各管加0.5ml冰乙酸,混勻。加3%高錳酸鉀溶液0.5ml,混勻,放置2min,使氧化去雜質。滴加3%雙氧水溶液數滴,直至高錳酸鉀的顏色褪掉。劇烈振搖此管,使多余的氧氣逸出。
    5.4 核黃素的吸附和洗脫
    A) 核黃素吸附柱:硅鎂吸附劑約1g用濕法裝入柱,占柱長1/2~2/3(約5cm)為宜(吸附柱下端用一團脫脂棉墊上),勿使柱內產生氣泡,調節流速約為60滴/min。
    B) 過柱與洗脫:將全部氧化后的樣液及標準液通過吸附柱后,用約20ml熱水洗去樣液中的雜質。然后用5.00ml洗脫液將樣品中核黃素洗脫并收集于一帶蓋10ml刻度試管中,再用水洗吸附柱,收集洗出之液體并定容至10ml,混勻后待測熒光。
    6 . 測定
    A) 于激發光波長440nm,發射光波長525nm測量樣品管及標準管的熒光值。
    B) 待樣品及標準的熒光值測量后,在各管的剩余液(約5~7ml)中加0.1ml20%低亞硫酸鈉溶液,立即混勻,在20s內測出各管的熒光值,作為各自的空白值。
    7. 計算
    (A-B)×S 100
    X = × f ×---
    (C-D)×m 1000
    式中: X--樣品中含核黃素的量,mg/100g;
    A --樣品管熒光值;
    B --樣品管空白熒光值;
    C --標準管熒光值;
    D --標準管空白熒光值;
    f --稀釋倍數;
    m --樣品的質量,g;
    S --標準管中的核黃素含量,μg;
    100
    -- --將樣品中核黃素量由μg/g折算成mg/100g的折算系數。
    1000
    注:1. 標準曲線由0.01μg至20μg間,呈良好的線形關系,所以每次測定樣品的同時,測定與樣品含量相近的標準即可。
    2.氧化去雜質,加入高錳酸鉀的量不宜過多,以避免加入雙氧水的量大,產生氣泡,影響核黃素的吸附及洗脫。


     

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