蛋白質的測定方法

測定食物中的蛋白質含量有二種方法，一是凱氏微量法，二是自動定氮分析法。
一．凱氏微量法
有手工滴定定氮和自動定氮儀定氮，實驗者可根據經濟條件設備而定。
1.原理
蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用過量硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
（NH4）2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4
2.方法
本法參照GB 5009.5 -85
適用于各類食品及飼料中蛋白質的測定
3.試劑
所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。試劑均為分析純。
3.1硫酸銅
3.2硫酸鉀
3.3濃硫酸
3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸）
3.5 混合指示劑：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。
3.6飽和氫氧化鈉：500g氫氧化鈉加入500ml水中，攪拌溶解，冷卻后放置數日，澄清后使用。
3.7 0.01mol/L或0.05mol/L鹽酸標準溶液：需標定后使用(配制及標定方法見附錄)
4.儀器
消化爐 凱氏定氮蒸餾裝置 萬分之一電子天平
凱氏定氮蒸餾裝置：如圖所示
5. 操作步驟
5.1樣品處理：精密稱取0.1~2.0g固體樣品或2~5g半固體樣品或吸取液體樣品5~20ml，放入100ml或500ml凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅，0.3g硫酸鉀及3~20ml濃硫酸，放置過夜后小心加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，取下放冷后用約2～10ml蒸餾水沖洗瓶壁，混勻后繼續加熱至液體呈藍綠透明，取下放冷，小心加10~20ml水混勻 ，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白實驗。
5.2按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發生瓶內裝水至約2/3處，加甲基紅指示液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃 珠以防暴沸，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
5.3向接收瓶內加入10ml ,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10ml樣品消化稀釋液由小玻璃杯流入反應室，并以10ml水洗滌小燒杯使之流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將3~10ml飽和氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其緩緩流入反應室，立即將玻璃塞蓋緊，并加水于小玻璃杯中以防漏氣。加緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾2min，移動接收瓶，使冷凝管下端離開液面，然后用少量中性水沖洗冷凝管下端外部，再蒸餾1min取下接收瓶，以0.01或0.05mol/L鹽酸標準溶液滴定至灰色或藍紫色為終點。
同時吸取10ml試劑空白消化液按5.3操作。
6. 計算
X = （V-V0 ）×C× 0.014× B/m ×100× F
式中：
X 一 樣品中蛋白質含量，g／100g；
V 一 樣品消耗鹽酸標準液的體積，ml;
V0 - 空白消化液消耗鹽酸標準液體積，ml;
C 一 鹽酸標準液摩爾濃度,mol/L;
0. 014一 1mol/L 鹽酸標準液1 ml相當氮克數.
B 一 定容體積/取液量
m 一 樣品的質量，g;
F 一 氮換算為蛋白質計算因子。蛋白質的氮素含量不同，故換算因子不同。詳見下表。
蛋白質計算因子
食 物 計算因子
蛋，魚，肉及制品，禽類，玉米，高粱，豆類，水果和蔬菜類 6.25
乳及乳制品 6.38
大米 5.95
小麥面 普通粉 5.70
全麥，大麥，燕麥，裸麥,小米，小麥面全麥 5.83
小麥 5.80
黃豆 5.71
花生 5.46
芝麻，向日葵 ，核桃和榛子 5.30
麩皮 6.31

7. 舉例
設取樣品0.1000g，消化后稀釋至100 ml; 。取10 ml樣品稀釋液，標準鹽酸為0.01 mol/L ，空白滴定為0.12 ml; ，樣品滴定用去的標準鹽酸為3.21 ml; ，測得樣品中蛋白質百分率為：
（3.21-0.12）×0.01×0.014×10／0.01× 100× 6.25
＝（3.21-0.12）×8.75＝27.0%
8. 附錄：
（1）標準HCl溶液（0.1 mol/L HCl）配制及標定：
配制：量取9毫升HCl，加適量水稀釋至1000毫升。
標定：精確稱取約0.15克左右在270～300℃干燥至恒重的基準無水碳酸鈉，加50毫升水使之溶解，加10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示液，（量取30ml 0.2%溴甲酚綠乙醇溶液，加入20ml 0.1%甲基紅乙醇溶液，混勻）用配制的鹽酸滴定至溶液由綠色變紫紅色，煮沸2min，冷卻至室溫，繼續滴定至溶液由綠色變為暗紫色。同時做試劑空白實驗。
（2）計算：
C = m
（v-v0）×0.0530
C - HCl標準滴定溶液的實際濃度,mol/L
m - 基準無水碳酸鈉的質量,g;
v - HCl標準滴定溶液用量,ml;
vo - 試劑空白HCl標準滴定溶液用量,ml;
0.0530-1.00 ml HCl標準滴定溶液〔C（HCl）=1mol/L〕相當基準無水碳鈉g。
0. 01mol/L HCl：精確吸取標定過的0.1mol/L HCl 10 ml，準確稀釋至100 毫升。必要時重新標定濃度。
9.注意事項:
9.1干樣用稱量紙稱重連紙一同消化，空白管同樣放稱量紙消化。
9.2 含糖量高和油脂高的樣品消化時容易溢出，加熱要緩慢。
9.3 稀釋樣品時消化液過熱，加水反應猛烈使樣品損失；消化液 過冷，加水后鹽析不溶解。

二、自動定氮分析法
1.原理
本方法為凱氏微量定氮法，將蛋白質的氮素轉化成氨，與硫酸化合成硫酸銨，然后測定氨量。由此計算出氮素含量，再乘以相應的系數即為蛋白質含量。 化學反應式如下：
2NH2(CH2)2COOH+13 H2SO4→(NH4)2 SO4+6CO2+12 SO2+16H2O
(NH4)2 SO4+2NaOH→2 NH3+2H2O + Na2SO4
2.方法來源
GB/T 6432-94 本法適用于各種食物和飼料的測定
3.儀器
KJELTEC AUTO 1030 ANALYZER（瑞典特卡托公司） 40孔消化爐
4.試劑
本實驗所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水
（1）濃硫酸 98% H2SO4
（2）凱氏片 （催化劑）K2SO4 + Se
（3）40%氫氧化鈉溶液（NaOH） W/V
（4）無水硫酸鈉 Na2SO4
（5）1%硼酸（H3BO4）吸收液 稱取100g硼酸溶于10L水中。加入100ml溴鉀酚綠溶液，再加入70ml甲基紅溶液，最后加入3ml 4%氫氧化鈉溶液。
（6）0.1mol/L鹽酸（HCL）標準溶液，標定后使用。
5.操作步驟
5.1樣品消化：稱取一定量的樣品于消化管中（半固體樣品用稱量紙稱取），加一粒凱氏片于消化管中，然后加入5ml濃硫酸，放置過夜，同時做樣品空白管。在消化過程中，先用低溫消化（防止高溫消化時樣品溢出），低溫消化1小時后，將溫度升到最高檔，至消化液無色透明。待消化液冷卻后，加入少量水沖洗消化管內壁，振搖，以免內壁粘有樣品以致消化不完全。然后于消化爐上再消化，直至液體無色透明。放置室溫后，加水至25ml，待測。
5.2樣品定氮：開啟1030自動分析儀電源，輸入測定時的參數，打開STEAM按鈕，產生蒸氣5分鐘，同時調節蒸氣表，使蒸氣表的指針指到NORMAL。最后將消化管裝入，關閉安全門，開始自動定氮。當CYCLE OVER燈亮時，記錄滴定結果，打開安全門，進行下一個樣品測定。
6.計算
蛋白質（g/100g）= （V-V0）×0.01401×N×f/m×100
V：樣品消耗鹽酸標準液的體積，ml；
V0：試劑空白消耗鹽酸標準液的體積， ml；
N：鹽酸標準溶液的摩爾濃度， mol；
0.01401：1mol鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數
f： 氮換算為蛋白質的系數（一般樣品的系數為6.25）；
m：樣品的質量，g；
7.注意事項
7.1 對含糖高的樣品或油脂樣品在消化過程中必須先低溫消化，防止樣品溢出，消化所需時間較長。
7.2 樣品的稱樣量不宜過多，否則試劑消耗多，消化時間長，適宜稱樣范圍在0.05～2.00g之間。
7.3 消化液過冷，在加水時，消化液有鹽析出。將消化管放在消化爐上加熱，使沉淀溶解。
7.4 使用自動分析儀時，定氮前，應將管路中的吸收液排出去，因為管路中的吸收液長時間停留會變色。
7.5 在產生蒸氣的水中加入無水硫酸鈉是為了提高水中的電解質。
7.6 本儀器消耗鹽酸標準溶液的用量最佳范圍在0.5～7ml。