摘要
島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀系統
內容
2007年，國內外發生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關產品被召回。2008年9月，國內發生奶粉中三聚氰胺導致嬰幼兒腎結石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。
目前對于三聚氰胺的檢測，最常規的方法為LC方法。但由于該化合物含有三個有機氮基團，極性強，在普通C18反相柱上難以保留，無法達到分離效果。文獻報導的HPLC方法基本都須加入離子對試劑以增加三聚氰胺的保留，但辛烷磺酸鈉等離子對試劑恰恰限制了LC-MS的應用。本文采用新型的SCX-C18混合填料色譜柱測定三聚氰胺，該柱內填充的是均勻混合的SCX和普通C18填料顆粒，兼具離子交換和反相分離的特點，檢測中不需加入離子對試劑，還可應用與LCsolution聯機，操作簡便，靈敏度高。
儀器概況
本實驗使用島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀系統。LC-20A是島津制作所投入整體力量開發的新一代高效液相色譜儀，具有以下特點：優越的基本性能，輕松滿足客戶對儀器嚴格的要求；全自動化操作，實現了分析的高效率；高度對應網絡要求的綜合管理系統，改善分析工作環境。
本次實驗所用儀器的具體配置為LC-20AD輸液泵，DGU-20A3在線脫氣，SIL-20A自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見檢測器，CBM-20A控制器和LCsolution色譜工作站。
分析方法色譜柱：CAPcell Pak CR(1:4) 4.6×150mm 5μm
檢測波長：243nm
流動相：15mM醋酸銨緩沖液(pH3.0):乙腈=7:3
流速：1.2mL/min
柱溫：30℃
進樣量：10μL
洗脫方式：等度洗脫。
樣品前處理方法 取奶粉樣品0.5g，準確加入5mL三氯乙酸溶液和0.2mL乙酸鉛溶液，搖勻，超聲提取20min。轉入離心管，在10000r/min離心機上離心5min，取上清液, 0.45μm濾膜過濾，上機測定。
分析結果
1.保留時間與峰形
圖1為本方法檢測三聚氰胺標樣的典型色譜圖（樣品濃度為5ug/mL）
圖1 三聚氰胺標樣圖譜
由圖1可見，本方法所測三聚氰胺保留時間為9.38min，峰形尖銳，對稱性好。
2.精密度
取濃度為5μg/mL三聚氰胺標樣，連續進樣5次，結果如表1所示。
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編號
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保留時間(min)
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峰面積(μV.S)
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1
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9.378
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113178
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|
2
|
9.388
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112902
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3
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9.397
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112677
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|
4
|
9.397
|
112874
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|
5
|
9.409
|
112909
|
|
Average
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9.394
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112908
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%RSD
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0.12
|
0.16
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表1 保留時間與峰面積的重現性
由表1結果可見，本方法測定三聚氰胺具有良好的精密度和重現性。
3.標準曲線 取標準品，用緩沖液稀釋成濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的標準工作液，分別進樣，得到校準曲線(見圖2)。
圖2 校準曲線
結果表明，該方法線性良好，相關系數為0.9999。
4.加標回收率 取奶粉空白樣品，加入不同濃度的三聚氰胺標準工作液，使奶粉中最終含量分別為0.5mg/kg、5mg/kg和50mg/kg，結果如下：
圖3 空白奶粉
圖4 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺
圖5 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺
圖6 空白奶粉添加50mg/kg三聚氰胺
加樣回收率結果如表2所示。
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加樣量(mg/kg)
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計算結果(mg/kg)
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回收率
%
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平均回收率%
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0.5
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0.55
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109.3
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115
|
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0.60
|
120
|
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5.0
|
4.56
|
91.2
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92.9
|
|
4.72
|
94.5
|
|
50
|
48.6
|
97.2
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97.8
|
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49.2
|
98.4
|
表2 3個不同濃度樣品回收率
5.檢測限和定量限
用軟件計算出奶粉中三聚氰胺含量檢測限為0.43mg/kg ，定量限為1.31mg/kg。
6.實際樣品分析結果 按本方法測定某品牌的奶粉，得到的圖譜如圖7所示。兩份重復樣品中測得三聚氰胺的濃度分別為19.7和19.8mg/kg，重現性良好。(用反相離子對色譜法測得的兩次結果分別為19.1和19.2 mg/kg)
圖7 某品牌陽性樣品檢測結果
結論
本方法定量限為1.31mg/kg，具有操作簡單方便，靈敏度較高和重現性好等優點。流動相中不用加入離子對試劑，為LCMS的分析提供了可能。且樣品經提取后可不用經過SPE步驟即可進樣，大大簡化了分析過程，節省了分析成本。本方法適合奶粉中三聚氰胺含量的測定，特別是大批量樣品的低成本快速檢測。
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