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  • 食物中維生素B6 的測定方法

    發布于 2011/12/12閱讀(2252)來源 zxj標簽 維生素

    摘要

    食物中維生素B6 的測定方法

    內容

    食物中維生素B6 的測定方法
    微生物法
    1.原理
    維生素B6在酸性介質中對熱比較穩定,但在堿性介質中對熱不穩定。測量維生素B6比較經典的方法是"微生物法"它的優點是:1.特異性高、精密度好、操作簡單(不需要特殊設備,易于推廣,樣品不需要進行一系列的提純步驟)、準確度高。它的缺點是:耗時長、必須經常保存菌種、試劑較貴。
    2.適用范圍
    GB/T 17407-1998,適用于藥物、食物及飼料的檢測
    3.儀器
    電熱恒溫培養箱
    電熱手提式壓力蒸汽消毒器
    液體快速混合器
    離心機
    722光柵分光光度計
    硬質玻璃試管
    4.試劑
    (1) 0.22mol/L硫酸:于2000ml燒杯中加入700ml水,加入12.32ml H2SO4,用水稀釋至1000ml。
    (2) 0.5mol/L硫酸:于2000ml燒杯中加入700ml水,加入28ml H2SO4,用水稀釋至1000ml。
    (3) 10mol/L氫氧化鈉:溶200g NaOH于水中,稀釋至500ml。
    (4) 0.1mol/L氫氧化鈉:取10ml 10mol/L NaOH,用水稀釋至1000ml。
    (5) 溴甲酚綠:0.04%溶液,稱取0.1g溴甲酚綠于研缽中,加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨,加少許水繼續研磨,直至完全溶解,用水稀釋到250ml。
    (6) 培養基:稱取吡哆醇Y培養基5.3g,溶解于100ml蒸餾水中。
    (7) 100ug/ml吡哆醇標準儲備液:稱取122mg鹽酸吡哆醇標準溶于1L25%乙醇中,保存于4℃冰箱中,穩定1個月。
    (8) 1ug/ml吡哆醇標準中間液:,取1ml吡哆醇標準儲備液,稀釋至100ml。
    (9) 瓊脂培養基:吡哆醇Y培養基5.3g,瓊脂1.2g,稀釋至100ml。
    (10) 1.5MOL/l生理鹽水:取9gNaCl溶于1000ml水中。
    5.菌種的制備與保存
    5.1儲備菌種的制備與保存:以卡爾斯伯酵母菌?SaccharomycesCarlsbergensis ATCC No.9080簡稱SC?純菌種接入2個或多個瓊脂培養基管中,在30±0.5℃恒溫箱中培養18-20小時,取出后置于冰箱中保存,至多不超過兩星期。保存兩周以上的菌種,不能立即用作制備接種用的種子液,一定要在使用前每天移種一次,連續2~3天,方可使用,否則生長不好。
    5.2種子培養液的制備:加0.5ml 50ng/ml的VB6標準應用液于尖管中,加入5ml基本培養基,塞好棉塞,于壓力蒸汽消毒器內(高壓鍋)151b壓力下消毒10min,取出,置于冰箱中,此管可保留數星期之久。
    6.操作步驟
    整個步驟要避光
    (1) 樣品制備:取樣0.5~10g(VB6含量不超過10ng)放入100ml三角瓶中,加0.22mol/LH2SO472ml。放入高壓蒸汽鍋121℃下水解5個小時,取出,于水中冷卻,用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4調PH值至4.5,用溴甲酚綠做指示劑。(指示劑由黃-黃綠色),將三角瓶內的溶液轉移到100ml容量瓶中,用蒸餾水定容至100ml,濾紙過濾,保存濾液即樣液于冰箱內備測定(保存期不超過36小時)。
    (2) 接種液的制備:使用前一天,將卡爾斯伯酵母菌菌種由儲備菌種管移種于已消毒的種子培養液中,可同時接種兩管,在30±0.5℃的恒溫箱中培養18-20小時。取出離心10分鐘(3000rpm)傾去上部液體,用已消毒的生理鹽水淋洗2次,再加10ml消毒過的生理鹽水,將離心管置于液體快速混合器上混合,使菌種成為混懸體,將此液倒入已消毒的注射器內,立即使用。3.樣品標準曲線的測定:取標準儲備液2ml稀釋至200ml成為中間液,從中間液中取5ml稀釋至100ml作為工作液,濃度為50ng/ml,3組試管各加0,0.02,0.04,0.08,0.12,和0.16ml工作液,再加5ml吡哆醇Y培養基,混勻,加棉塞。
    (3) 試樣的測定:在試管中分別加入0.05,0.10,0.20ml樣液,再加入5ml吡哆醇Y培養基,用棉塞塞住試管,將制備好的標準曲線和試樣測定管放入高壓鍋(121℃,15磅/英寸2)高壓10min,冷至室溫備用。
    (4) 接種和培養:每管接種一滴接種液,于30±0.5℃恒溫箱中培養18-22小時
    (5) 測定:從恒溫箱中取出后,用722分光光度計測量,用空白管調零。550nm波長下,測定各管的吸光度值,以標準管所含VB6的濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制VB6標準工作曲線,用測定管得到的吸光度值,在標準曲線上查到測定管內所含VB6的量。
    7.計算
    各樣管的吡哆醇含量A為:
    A(ng/ml)=(x1/V1+x2/V2+x3/V3)/3
    則樣品的吡哆醇含量為:
    mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104
    每個樣品各測定管的吡哆醇含量為x1,x2,x3;
    取液量分別為V1,V2,V3
    樣品重W(g)取液量V(ml),
    定容至100ml
    8.注意事項
    (1) 所有步驟需要避光處理
    (2) 培養時每管必須在同一溫度,培養時間以18-24hour為宜。
    (3) 本實驗所有用水皆采用蒸餾水。


     

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